radio muadz 94,3 fm kendari

radio muadz 94,3 fm kendari
radio muadz 94,3 fm kendari

February 02, 2011

identifikasi protein

BAB I
PENDAHULUAN
A.  Latar Belakang
Asam amino merupakan monomer yang menyusun polimer-polimer pada prtein. Asam amino dapat mengalami proses hidrilisis yang menghasilkan hidrolisat protein. Hidrolisat protein didefinisikan sebagai protein yang mengalami degradasi hidrolitik dengan asam atau basa kuat dengan hasil akhir berupa campuran beberapa hasil. Fungsi hidrolisat protein dapat sebagai penyedap atau sebagai intermedia tes untuk isolasi dan memperoleh asam amino secara individu atau dapat pula untuk pengobatan yaitu sebagai diet untuk penderita pencernaan.
Dengan menggunakan teknik kromatografi, berbagai macam asam amino dalam hidrolisat protein dapat diidentifikasi. Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya.Selain teknik ini, ada berbagai cara dalam pengujian terhadap protein yaitu dengan reaksi uji asam amino dan reaksi uji protein. Reaksi uji asam amino sendiri terdiri dari 6 macam uji yaitu: uji millon, uji hopkins cole, uji belerang, uji xantroproteat, dan uji biuret. Sedangkan untuk uji protein, berdasarkan pada pengendapan oleh garam, pengendapan oleh logam dan alkohol. Serta uji koagulasi dan denaturasi protein. Pada uji asam amino terdapat uji bersifat umum dan uji berdasakan jenis asam aminonya.  Seperti halnya uji millon bersifat spesifik terhadap tirosin, uji Hopkins cole terhadap triptofan, uji belerang terhadap sistein, uji biuret bereaksi positif terhadap pembentukan senyawa kompleks Cu gugus –CO dan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Serta uji xantroproteat bereaksi positif untuk asam amino yang mengandung inti benzena. Oleh karena itu dalam praktikum ini akan dilakukan hidrolisis protein dan identifikasi asam amino dari telur bubuk.

B.  Permasalahan
Dari pemaparan di atas, timbul permasalahan yang selanjutnya akan dikaji dalam praktikum ini, yaitu
1.    Bagaimana menghidrolisis protein dari telur ?
2.    Bagaimana mengetahui komponen asam amino penyusun protein hasil hidrolisis dengan menggunakan kromatografi lapis tipis?
C.  Tujuan
Dari permasalahan yang diajukan, maka tujuan praktikum ini yaitu antara lain :
1.    Untuk mengetahui cara menghidrolisis protein dari telur
2.    Untuk mengetahui komponen asam amino penyusun protein hasil hidrolisis dengan menggunakan kromatografi lapis tipis.
D.  Manfaat
Manfaat yang diperoleh dari praktikum  ini, antara lain :
1.    Dapat mengetahui identifikasi asam amino yang mengandung sulfur dan inti benzen.
2.    Dapat mengetahui komponen asam amino dari protein yang terdapat dalam telur dengan menggunakan kromatografi lapis tipis.


BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A.  Protein
Komposisi telur dapat dikatakan sangat beragam tergantung pada beberapa faktor, antara lain bangsa sapi, tingkat laktasi, pakan, interval pemerahan, temperatur dan umur sapi, akan tetapi angka rata-rata untuk semua jenis kondisi dan jenis sapi perah adalah sebagai berikut: kadar air 87,1%, lemak 3,9%, protein 3,4%, laktosa 4,8%, kadar abu 0,72% dan beberapa vitamin yang larut dalam lemak telur, yaitu vitamin A, D, E dan K (Abu bakar dkk, 2005).
Protein merupakan polimer heterogen molekul-molekul asam amino. Dalam protein globuler, rantai-rantai samping hidrofil dan polar berada di bagian luar dan rantai samping hidrofob dan nonpolar berada di bagian dalam (Purwoko dkk, 2007). Protein adalah sumber asam amino yang mengandung unsur C, H, O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak dan karbohidrat (Abu bakar dkk, 2005). Protein memiliki makromolekul (BM > 40.000) dan termasuk juga kelompok makronutrien dengan Polipeptida rantai panjang dengan salah satu ujungnya berupa asam karboksilat dan ujung lainnya gugus amina.
Protein dapat diklasifikasikan berdasarkan fungsi biologinya, yaitu sebagai enzim, protein transport, protein nutrient dan penyimpan, protein kontraktil atau motil, protein structural, protein pertahanan, dan protein pengatur. Protein dapat juga dibagi menjadi dua golongan utama berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisiknya, yaitu protein globular dan protein serabut (Lehninger, 1982).  Berdasarkan komposisi kimianya, protein dibagi atas:
1. Simple Protein:
Merupakan protein yang hanya mengandung 1-alfa-asam amino atau derivatnya. Beberapa contoh Simple Protein antara lain: albumin, globulin, glutein, protamin, albuminoid, dan histon.
2. Conjugated Protein:
Merupakan protein yang bergabung dengan zat yang bukan protein. Zat yang bukan protein ini disebut gugus prostetik. Beberapa contoh Conjugated Protein antara lain: nukleoprotein, glikoprotein, fosfoprotein, lipoprotein, dan metalloprotein.
Sifat-sifat struktural protein dianggap berada dalam 4 buah telurnan yaitu :
a. Struktur primer : rangkaian asam amino dan lokasi setiap ikatan disulfida dikode dalam gen
b. Struktur sekunder : pelipatan rantai polipeptida menjadimultiplikasi motif terikat hidrogen seperti struktur α-heliks dan β-pleated sheet. Kombinasi motif-motif ini dapat membentuk motif supersekunder.
c. Struktur tersier : hubungan anta-domain struktural sekunder dan antar-residu yang letaknya terpisah jauh dalam pengertian struktur primer.
d. Struktur kwartener : hanya terdapat dalam protein oligomerik ( protein dengan dua atau tiga rantai polipeptida), menjelaskan titik-titik kontak dan hubungan lainnya antara polipeptida atau subunit inti
(Panil, 2004).
Sembilan puluh persen dari protein sel adalah enzim-enzim yang kepadanyalah tergantung struktur dasar yang menentukan fungsi sel. Fungsi protein dalam tubuh adalah membangun dan menjaga atau memelihara protein jaringan dan organ tubuh, menyediakan asam-asam amino makanan, menyediakan enegi dalam tubuh, menyediakan sumber lemak badan, menyediakan sumber gula darah, sumber glikogen darah, sumber enzyme tubuh, sumber beberapa hormon dalam tubuh, menyediakan bangunan dasar untuk setidak-tidaknya satu vitamin B komplek, menyediakan komponen tertentu dari DNA, RNA dan ATP (Triyono, 2007).
B.  Hidrolisis Protein
Ikatan peptida yang membangun rantai polipeptida dalam protein dapat diputus (dihidrolisis) menggunakan asam, basa atau enzim pemecahan ikatan peptida dalam kondisi asam atau basa kuat merupakan proses hidrolisis kimia dan pemecahan ikatan peptida menggunakan enzim merupakan proses hidrolisis biokimia reaksi hidrolisis peptida akan menghasilkan produk reaksi yang berupa satu molekul dengan gugus karboksil dan molekul lainnya memiliki gugus amina (Juniarso dki, 2007).
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran                     bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antar asam amino tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi adalah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, dan kromatografi penukar ion (Poejadi, 1994).
C.  Identifikasi Asam Amino
Peptida dan protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil. Jika bobot molekul senyawa lebih kecil dari 6.000, biasanya digolongkan sebagai polipeptida (Astuti, 1999). Asam amino merupakan komponen penyusun utama protein dan dibagi dalam dua komponen yaitu asam amino esensial dan asam amino non esensial. Asam amino esensial tidak dapat diproduksi dalam tubuh sehingga sering harus ditambahkan dalam bentuk makanan, sedangkan asam amino non esensial dapat diproduksi dalam tubuh. Asam amino umumnya berbentuk serbuk dan mudah larut dalam air, namun tidak larut dalam pelarut organik non polar (Sitompul, 2004).
Asam amino dan protein secara umum mempunyai sifat-sifat fisik yang sama. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada protein.
Dari struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi (Girindra, 1993).

D.    Plat KLT
            Plat KLT digunakan untuk mendeteksi keberadaan suatu senyawa dalam sampel dengan memdandingkan nilai Rf yang diperoleh pada sampel dan nilai Rf senyawa standar. Plat KLT sering dikombinasikan dengan kromatografi kolom untuk mengidentifikasi fraksi-fraksi yang dipisahkan dari suatu sampel. Prinsip yang digunakan Kromatografi Lapis Tipis ini adalah perambatan eluen yang membawa senyawa tertentu pada media fase diam, yakni plat KLT. Eluen atau fasa gerak yang digunakan haruslah merupakan campuran dari beberapa larutan yang memiliki kepolaran yang berbeda, tujuannya agar senyawa-senyawa yang memiliki kepolaran yang berbeda-beda dapat dipisahkan dengan eluen tersebut (Rahmat, 2010).


BAB III
METODE PERCOBAAN
A. Waktu dan Tempat Percobaan
Percobaan ini dilaksanakan pada hari Senin 11 Oktober 2010 bertempat di Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Haluoleo Kendari, Sulawesi Tenggara.
B. Alat dan Bahan
1.    Alat Praktikum
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu Erlenmeyer 250 mL 2 buah, labu takar 50 mL 2 buah, batang pengaduk, gelas kimia 100 mL, neraca analitik, autoclave, hot plate, botol semprot, pipet ukur 10 mL, chamber, pipet tetes, corong, gegep, filler, dan masker.
2.    Bahan Praktikum
Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu telur bebek, HCl pekat 10 mL, Ba(OH)2 10 mL, akuades, NaOH 40% 1 mL, HNO3  pekat 1 mL, Pb-asetat, larutan ninhidrin, dan kertas saring.


C.  Prosedur Kerja
1). Hidrolisis protein secara kimia
 


-    Dimasukkan dalam labu erlenmeyer 50 mL
-    Ditambahkan  10 mL HCl 8 N
Larutan dalam erlenmeyer
 
 

                                         
-    Disumbat labu menggunakan kapas
-    Dibungkus dengan kertas
                                                            -  Dimasukkan dalam autoklaf 1 atm

Hidrolisat
 
 



-    Diamati warnanya
-    Diukur pHnya
-    Ditambahkan Ba(OH)­2.8H2O sampai pHnya netral
-    Ditambahkan air mendidih
-   
Endapan
 
Filtrat
 
Disaring



 

                           -  Disimpan untuk percobaan                          - Dibuang
                              selanjutnya


2).  Uji Ninhidrin
 




                      
                    Larutan berwarna biru

3).  Uji Sulfur
Filtrat
 
 
      
-          ditambahkan 1 mL NaOH
-          dipanaskan
-          ditambahkan Pb-Asetat
 
 




              Larutan menjadi berwarna cokelat

4).  Uji Intibenzena

Filtrat
 
               
-          ditambahkan 1 mL HNO3 pekat
-          dipanaskan
-          didinginkan
-          dibagi menjadi dua larutan
-          larutan 1 ditambahkan NH4OH
 
 




                                   
                       Warna kuning menjadi berwarna kuning
5).  Kromatografi lapis tipis asam amino (hasil hidrolisis protein)

Sampel                                       (protein hasil hidrolisis)
 
Asam amino standar
 
 






                                                                  -  Diteteskan masing-masing pada kertas kromatografi dengan pipet kapiler secara berdampingan dengan jarak 2-3 cm
Eluat pada plat kromatografi
 
                                                                 

                                                                                                                 

                                                                  -  Dijenuhkan dengan uap eluen pada chamber
                                                                  -  Dibiarkan eluen meresap pada plat kromatografi hingga jarak 4,5 cm
                                                                  -  Dikeluarkan dari chamber             
                                                                  -  Dikeringkan pada suhu 105°-110°C
                                                                  -  Disemprot dengan larutan ninhidrin
                                                                  -  Dikeringkan lagi pada suhu 105°-110°C selama 5 menit
 


                                                                  -  Dihitung jarak  noda-noda asam amino pada kertas kromatografi
                                                                  -  Dihitung nilai Rf tiap noda dan dicatat nodanya
                                    Nilai Rf dari masing-masing noda = ...

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A.  Hasil Pengamatan
No.
Perlakuan
Pengamatan
1.





2.





















Hidrolisis Protein
-     Telur cair + 10 mL HCl Pekat diautoklaf hingga 15 Psi
-     Hidrolisat disaring, filtratnya dibagi menjadi dua larutan

Uji Kualitatif
a)      Asam Amino mengandung S
-   Lar. 1 + 1 mL NaOH 40% dipanaskan + Pb Asetat 3 tetes
-   Lar. 2 + 1 mL NaOH 40% dipanaskan + Pb Asetat 3 tetes

b)      Asam Amino mengandung inti benzene
-   Lar. 1 + 1 mL HNO3 pekat dipanaskan, didinginkan, dibagi 2. Larutan pertama + NH4OH
-   Lar. 2 + 1 mL HNO3 pekat dipanaskan, didinginkan, dibagi 2. Larutan pertama + NH4OH

c)      Uji Ninhidrin
-   Lar. 1 + 0.5 mL ninhidrin dipanaskan.
-   Lar. 2 + 0.5 mL ninhidrin dipanaskan.


Terbentuk hidrolisat


-    Larutan 1 + putih telur
-    Larutan 2 + kuning telur



-    larutan berubah menjadi warna kuning
-    larutan menjadi cokelat kehitaman
Uji Positif


-    larutan kurang mengandung inti benzen
-    larutan banyak mengandung inti benzen




Larutan berwarna biru, uji positif Ninhidrin.



Uji Kuantitatif dengan Kromatografi Kertas:
Rf Sampel
Rf Asam Amino
s  Rf P1      =
s  Rf P2      =
s  Rf P3      =
s  Rf P4        =
s  Rf P5      =
s  Rf P6      =
s  Rf K1      =
s  Rf K2      =
s  Rf K3        =
s  Rf K4      =
s  Rf K5      =
s  Rf K6      =


s  Rf Alanin           =
s  Rf Arginine        =
s  Rf Asparagine   =
s  Rf Tryptophane  =
s  Rf Cystine          =
s  Rf As. Glutamat            =
s  Rf Glysine          =
s  Rf L-Tyrosine    =
s  Rf Metionin       =
s  Rf Phenilalamin =
s  Rf Serine            =
s  Rf Valine           =





B. Pembahasan
Hidrolisis yang dilakukan pada percobaan ini dengan sampel telur ayam ras yaitu menggunakan asam sulfat pekat. Hidrolisis ini dilakukan selama 1 jam didalam autoklaf dengan tujuan untuk mensterilkan bahan dengan uap air panas bertekanan. Hidrolisat yang dihasilkan ternyata memiliki warna coklat tua karena protein dari telur tersebut telah mengalami kerusakan akibat teroksidasi. Hidrolisat yang diperoleh harus dinetralkan terlebuh dahulu agar proses selanjutnya berjalan stabil (pada pH normal). Penetralan dilakukan dengan menambahkan NH4OH sampai suasana netral yang diidentifikasi dengan menggunakan kertas pH.
Identifikasi asam amino dilakukan dengan dua uji, yaitu uji asam amino mengandung sulfur dan uji asam amino mengandung inti benzena. Pada uji asam amino mengandung sulfur dilakukan dengan penambahan NaOH 40% pada hidrolisat dan dipanaskan untuk mendenaturasi asam amino sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat membentuk PbS, sehingga diperoleh perubahan warna larutan dari kuning pekat menjadi cokelat kehitaman. Dengan terbentuknya endapan PbS menunjukkan uji positif terhadap asam amino yang mengandung atom S. asam amino yang mengandung atom S adalah Sistein dan Metionin, adapun struktur dari kedua asam amino tersebut dapat dilihat sebagai berikut:
Akan tetapi berdasarkan data Rf yang diperoleh dari hasil elusi kandungan telur, tidak didapatkan Rf yang sesuai dengan Rf standar kedua asam amino ini, namun tetap saja endapan PbS terbentuk. Nampaknya terjadi kesalahan dalam pengukuran Rf sampel yang mana mengakibatkan tidak cocoknya Rf standard dan Rf sampel untuk senyawa asam amino yang mengandung atom S. Berdasarkan hasil Rf yang paling dekat dengan Rf standar adalah Rf P5 yang bernilai 0,2 dan Rf sistein yang bernilai 0, sedangkan Rf metionin adalah 0,51 dan yang mendekatinya Rf P1 yang bernilai 0,43. Sehingga dapat dipastikan asam amino yang terdapat pada sampel telur adalah asam amino sistein.
Uji selanjutnya adalah identifikasi asam amino mengandung inti benzen, asam amino yang mengandung inti benzene ada tiga yaitu fenilialanin, tirosin dan triptofan. Fenilalanin banyak digunakan di industi makanan dan minuman sebagai penambah kandungan protein sintetik. Struktur dari ketiga senyawa ini adalah:
Uji asam amino dengan inti benzene dilakukan dengan penambahan HNO3 pada hidrolisat. Setelah itu campuran dipanaskan sehingga diperoleh perubahan warna larutan dari kuning pekat menjadi kuning muda. Inti benzen dapat ternitrasi oleh HNO3 pekat menghasilkan turunan nitrobenzen. Dari nilai Rf yang diperoleh pada hasil elusi eluen dan sampel menunjukkan adanya Rf asam amino sampel yang identik dengan Rf asam amino standar, yaitu yang ditunjukkan oleh Rf K5 yang bernilai sama dengan Rf asam amino triptofan yakni 0,23. Selanjutnya Rf yang hampir sama dengan asam amino tirosin ditunjukkan pada Rf P5 yang bernilai 0,2. Dan tidak ada Rf yang mendekati dengan Rf fenilalanin. Sehingga dapat dipastikan asam amino tirosin dan triptofan terkandung dalam sampel telur yang digunakan.
Semua Rf yang ditampilkan di atas diperoleh dengan mengelusi sampel dengan eluen pada plat Kertas, eluen yang digunakan berupa campuran n-butanol, asam asetat dan air dengan perbandingan 8:2:8. Eluen yang digunakan harus merupakan campuran dari larutan-larutan tertentu dengan kepolaran yang berbeda-beda, fungsinya adalah agar eluen dapat membawa jenis-jenis senyawa yang terkandung di dalam sampel yang sejenis dengan kepolaran eluen. Ketika sampel dielusi dengan eluen komponen-komponen dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan dan kecepatan yang berbeda. Hasil deri elusi ini belum dapat dilihat dengan jelas sehingga perlu dioleskan larutan ninhidrin pada plat kertas yang kemudian dikeringkan di dalam oven. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna khas ungu-biru sampai kecoklatan seperti reaksi berikut:
            Nampaknya dari hasil pembacaan Rf pada sampel didapatkan tidak hanya Rf asam amino yang diujikan, melainkan terdapat pula asam amino lain seperti Arginin yang identik dengan Rf P5 yakni 0,2; valine yang identik dengan Rf P1 yakni 0,43 dan asam glutamate yang identik dengan Rf K5 yakni 0,23. Ketiga senyawa tersebut memiliki struktursebagai berikut:



DAFTAR PUSTAKA
Abubakar dan M. Ilyas, 2005. Mutu Telur Karamel Asal Telur Pecah Selama Penyimpanan. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2005.

Astuti, Yeti, 2009, Analisi Protein, Gramedia, Jakarta.

Girindra, Aisjah, 1993, Biokimia 1, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Juniarso, E., T., Safari, A., dan Pamungkas, R., A., 2007, Pemanfaatan Limbah Ikan  Menjadi Ekstrak Kasar Protease Dari Isi Perut Ikan Lemuru (Sardinella Sp.) Untuk Proses   Deproteinisasi Limbah Udang Secara Enzimatik Menjadi Kitosan, Universitas Jember.

Lehninger, Albert l. 1982. Dasar – Dasar Biokimia Jilid I.  Erlangga. Jakarta.

Panil, Zulbadar. 2004. Memahami Teori dan Praktek Biokimia Dasar Medis. Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

Poedjadi, Anna, 1994, Dasar-Dasar Biokimia, Universitas Indonesia. Jakarta.

Purwoko, T., Handajani, N., S., 2007, Kandungan Protein Kecap Manis Tanpa Fermentasi Moromi Hasil Fermentasi Rhizopus oryzae dan R. oligosporus, BIODIVERSITAS, Vol 8, Nomor 2, Hal, 223-227.

Rahmat, Mifta Nur, 2010, Ulasan Sekilas Mengenai KLT, Kendari: Zam-zam Office.

Sitompul, S., 2004, Analisis Asam Amino dalam Tepung Ikan dan Bungkil Kedelai, Buletin Tekhnik Pertanian, Vol. 9, Nomor 1.

Triyono, 2007, Pengaruh Tingkat Protein Ransum Pada Akhir Masa Kebuntingan Pertama Terhadap Performan Dan Berat Lahir Pedet Sapi Perah Peranakan Friesian Holstein (Pfh), Universitas sebelas Maret, Surakarta.



No comments: