radio muadz 94,3 fm kendari

radio muadz 94,3 fm kendari
radio muadz 94,3 fm kendari

February 02, 2011

High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)

BAB I
PENDAHULUAN
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 1986).
Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).
HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit tentang High Perfomance Liquid Chromatography.

BAB II
PEMBAHASAN

  1. Perkembangan Kromatografi
Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut  oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih (Sudjadi, 1986).
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).
  1. Teknik Pemisahan dengan HPLC
Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing-masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa diam.
Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai. Selain dari beberapa factor ini, hal utama yang harus diperhatikan adalah pengetahuan yang baik mengenai HPLC serta pengalaman dan keterampilan kerja yang baik. Pelarut yang digunakan dialirkan terus menerus secara kontinyu ke dalam pompa.
Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. Faktor kapasitas (k’) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k’ kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k’ yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k’ optimum, yaitu antara 1 sampai 10.
Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen. Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan  dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi ‘R’ (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R ≥ 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik. Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan nilai Tf < 2,0. Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).
Kromatogram HPLC merupakan relasi antara tanggapan detector sebagai kordinat dan waktu sebagai absis dalam sistem koordinat Cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel (Ahmad dan Suherman, 1991).

Berikut dapat dilihat susunan peralatan HPLC, yaitu :
1.   Tempat peletakan fasa gerak (reservoir)
Pada tempat fasa gerak kebersihannya harus terjaga, agar tidak ada zat-zat pengotor yang dapat mengotori pelarut. Fasa gerak (pelarut) bermacam-macam kepolaritasannya. Sebab diharapkan agar komponen yang akan dipisahkan memiliki sifat yang sama dengan pelarut, sehingga zat tersebut dapat terpisahkan.
2.   Pompa
Untuk mengalirkan fasa gerak digunakan pompa, yang akan mengalirkan fasa gerak ke dalam sistem. Pompa yang baik adalah pompa yang dapat memompakan fasa gerak secara konstan, memiliki batas tekanan maksimal yang cukup tinggi (3000-6000 Ф), tidak mengandung bahan yang reaktif terhadap pelarut, cara kerjanya sederhana, mempunyai noise yang rendah, dan mempunyai fluktasi tekanan minimal.
3.   Injector
Ketepatan jumlah volume yang diijeksikan sangat penting untuk analisi kuantitatif. Oleh karena itu, tipe injector yang digunakan pada HPLC adalah injector dengan pipa dosis. Suatu injector dikatakan baik apabila memiliki keberulangan yang tinggi, mudah digunakan, dan dapat digunakan pada keadaan dimana tekanan balik pada kolom relative lebih tinggi.
Agar injector tetap awet, maka setiap selesai analisa injector dicuci dengan menggunakan pelarut (fasa gerak) yang digunakan, dan jangan mengganti posisi injector dengan posisi load ke posisi injek karena dapat menyebabkan seal pada injector cepatrusak atau aus.
4.   Kolom
Kolom merupakan area terjadinya pemisahan komponen-komponen yang dianalisa. Sama halnya dengan injector, setelah menganalisa kolom harus dicuci, dan direndam dalam pelarut organic yang sesuai. Jika fasa gerak yang digunakan diganti dengan yang kepolaritasannya berbeda maka harus menggunakan pelarut perantara dalam kolom tersebut. Laju alir pelarut pun perlu diperhatikan, sebab jika laju alirnya tinggi dapat menyebabkan kolom rusak atau tersumbat.
5.   Detektor
Detektor digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan.
Suatu detector harus memiliki kepekaan tinggi; limit deteksi kecil; noise rendah, stabil dan mempunyai keberulangan naik; tidak terpengaruh oleh perubahan suhu, dan yang terpenting memberikan respon terhadap bermacam-macam jenis senyawa.
6.   Recorder
Recorder berfungsi sebagai sistem pencatat yang mampu menampilakan kromatogram dengan jelas tepat dan cukup peka. Recorder ini mampu menampilkan puncak-puncak kromatogram dengan jelas dan tidak terganggu oleh noise listrik.
Secara sederhana, desain alat HPLC (HPLC) dapat ditunjukkan pada gambar berikut.

Pada penggunaannya, eluen yang akan digunakan dialirkan dengan pump A dan pump B dengan perbandingan volume yang dikontrol melalui monitor. Pelarut-pelarut tersebut akan melalui degassit untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara dalam pelarut tersebut. Sampel yang ingin dianalisis diinjeksikan melalui injektor dan akan bercampur dengan eluen didalam mixer yang selanjutnya akan mengalir menuju kolom untuk dilakukan pemisahan. Out put data akan ditampilkan pada monitor, baik berupa data kualitatif mupun kuantitatif.
Data kualitatif diperoleh dalam bentuk spktrum dengan cara membandingkan dengan spktrum standar sehingga dapat diidentifikasi suatu zat atau senyawa. Sedangkan data kuantitatif langsung ditunjukkan pada layar berupa kadar atau konsentrasi suatu zat yang ingin ditentukan.

  1. Kelebihan HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:
ü   Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
ü   Mudah melaksanakannya
ü   Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
ü   Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
ü   Resolusi yang baik
ü   Dapat digunakan bermacam-macam detektor
ü   Kolom dapat digunakan kembali
ü   Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
ü   Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
ü   Banyak pilihan fasa geraknya
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam HPLC
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press. Surabaya.

                                               . 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.
Putra, Effendy D. L., 2004. ’Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi’ J. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3-6.

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

No comments: